Setelah menamatkan penyelidikan kedoktorannya di Universiti Nagoya pada tahun 1972, Kobayashi bekerja sebagai rakan penyelidikan dalam bidang fizik zarah di Universiti Kyoto. Bersama rakannya, Toshihide Maskawa, dia berusaha menjelaskan pelanggaran CP di dalam Model Piawai fizik zarah. Teori Kobayashi dan Maskawa mensyaratkan bahawa terdapat sekurang-kurangnya tiga generasi kuark, satu ramalan yang disahkan eksperimen empat tahun kemudian menerusi penemuan kuark bawah.

Makalah Kobayashi dan Maskawa, "CP Violation in the Renormalizable Theory of Weak Interaction"[7] diterbitkan pada tahun 1973, merupakan sebuah makalah fizik tenaga tinggi yang keempat paling banyak dirujuk sepanjang masa setibanya tahun 2010.[8] Matriks Cabibbo–Kobayashi–Maskawa, yang mentakrifkan parameter pencampuran di antara kuark adalah hasil daripada kerja ini. Kobayashi dan Maskawa bersama-sama dianugerahkan separuh daripada Hadiah Nobel Fizik 2008 untuk kerja ini, dan separuh lagi diberikan kepada Yoichiro Nambu.[1]

Sebagai penghargaan ke atas sumbangan tiga orang pemenang Nobel, patung-patung gangsa Shin'ichirō Tomonaga, Leo Esaki, dan Makoto Kobayashi telah didirikan di Central Park Azuma 2 di Tsukuba City pada tahun 2015.[9]